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腦性癱瘓(CP)是由腦發(fā)育缺陷或非進(jìn)行性腦損傷所致,常發(fā)生在2歲以下小兒中,發(fā)病率約1~3%。兒童痙攣性腦癱常表現(xiàn)為肌肉無力、痙攣、選擇性運動控制喪失,以及原發(fā)性腦損傷導(dǎo)致的姿勢控制受損。
在臨床上,腦癱患兒通常表現(xiàn)出動態(tài)馬蹄足,存在膝關(guān)節(jié)過伸、過度擴(kuò)張、三頭肌群收縮缺失等問題。臨床上尚未發(fā)現(xiàn)根治CP的方法,雖然替代藥物經(jīng)常被使用,但并未發(fā)現(xiàn)有效證據(jù)支持其使用,一般是通過康復(fù)性治療、藥物和手術(shù)來改善患兒運動功能。
本研究使用脂多糖(LPS)與缺氧/缺血(H/I)聯(lián)合誘導(dǎo)建立CP大鼠模型,采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS /MS)聯(lián)合tmt-標(biāo)簽定量方法探討白脈軟膏對CP大鼠腦損傷的治療作用。
大鼠隨機(jī)分為4組,每組10只(5只雄性,5只雌性),分別為白脈軟膏組、安慰劑組、模型組和對照組。在白脈軟膏組大鼠背部的皮膚表面(從第7天到第40天)局部涂抹奇正白脈軟膏1.5mL/只/日;在安慰劑組CP大鼠組背部皮膚表面局部涂抹安慰劑1.5mL/天(從第7天至第40天)。
同時,研究人員要在上午8~11時評估大鼠的運動能力,從出生后30~40天每5天進(jìn)行一次旋轉(zhuǎn)測試,測試系列以40rpm的速度進(jìn)行一系列測試,記錄了每只大鼠的墜落時間。最后,收集其血清、海馬和運動皮層樣本進(jìn)行指標(biāo)檢測。
01 CP大鼠蛋白質(zhì)的質(zhì)譜定量分析
LC-MS/MS對海馬體的分析顯示,共有2551種蛋白質(zhì)含有2種或更多獨特的肽;在運動皮層中,共發(fā)現(xiàn)2521種蛋白質(zhì),其中2種或2種以上為獨特的肽。在本研究中,海馬中發(fā)現(xiàn)了1397種改變的蛋白質(zhì),其中582個蛋白在安慰劑組大鼠中表達(dá)下調(diào)(與正常對照組相比),而在白脈軟膏組大鼠中表達(dá)上調(diào)(與安慰劑組相比),還有815個蛋白表現(xiàn)出相反的趨勢。在大腦皮層中,發(fā)現(xiàn)了1843種改變的蛋白質(zhì),其中564個蛋白在對照組中表達(dá)下調(diào),而在白脈軟膏組中表達(dá)上調(diào)(與安慰劑組CP大鼠相比),1279種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出相反的趨勢。
02利用生物信息學(xué)分析預(yù)測CP大鼠海馬蛋白功能分類
通過信號通路對海馬體的1397個改變的蛋白質(zhì)和運動皮層的1843個改變的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)CP組間表達(dá)蛋白和下調(diào)蛋白的富集分?jǐn)?shù)最高。在已識別的通路中,最熱門的是海馬區(qū)細(xì)胞質(zhì)核糖體蛋白、gpcr-C類代謝谷氨酸、信息素和膽固醇代謝通路(圖1),以及運動皮質(zhì)區(qū)絲裂原活化激酶(MAPK)信號通路和膽固醇代謝通路(圖1)。
有趣的是,在海馬體和運動皮層中,與對照組健康大鼠相比,在安慰劑組CP大鼠中,各種膽固醇代謝途徑的催化酶的表達(dá)上調(diào),與安慰劑組CP大鼠(圖1)相比,白脈軟膏組各種膽固醇代謝途徑的催化酶的表達(dá)下調(diào)。同時,膽固醇合成途徑中的Hmgcs1、Idi1和sql催化酶也發(fā)生了類似的改變。運動皮質(zhì)中只有Mvd、Fdps和Dhcr7發(fā)生改變,而海馬中沒有。與安慰劑組CP大鼠相比,白脈軟膏組CP大鼠Rps6ka1表達(dá)明顯降低。同樣,第40S核糖核糖核糖蛋白RPS8、RPS9、RPS25和RPS27的表達(dá)也受到了控制。
與對照組健康大鼠相比,Grm4表達(dá)在用安慰劑組CP大鼠中明顯上調(diào),與安慰劑組的CP大鼠相比,白脈軟膏組CP大鼠Grm4表達(dá)明顯下調(diào)。與對照組相比,安慰劑組CP大鼠的上述蛋白表達(dá)水平下降,而白脈軟膏組CP大鼠的上述蛋白表達(dá)水平上升。
這些結(jié)果表明,MAPK通路的關(guān)鍵蛋白質(zhì)受到白脈軟膏治療的影響。
03免疫化學(xué)染色
使用免疫組化法定位大鼠海馬中CP相關(guān)蛋白的表達(dá)(圖2),與對照組相比,在安慰劑CP大鼠中,組蛋白3.3和組蛋白4的表達(dá)被下調(diào)。然而,與對照組和安慰劑組相比,白脈組CP大鼠組蛋白3.3和組蛋白4表達(dá)上調(diào)。與對照組相比,模型組CP大鼠和安慰劑組CP大鼠的PKC-δ和外周蛋白表達(dá)上調(diào);然而,與對照組和安慰劑組相比白脈治療組CP大鼠的PKC-δ和周圍蛋白表達(dá)下調(diào)。
使用免疫組化定位大鼠運動皮質(zhì)中CP相關(guān)蛋白的表達(dá)(圖3)。與對照組相比,模型組CP大鼠和安慰劑組CP大鼠組蛋白3.3和組蛋白4表達(dá)下調(diào); 而白脈軟膏組大鼠組蛋白3.3和組蛋白4表達(dá)上調(diào),對照組組蛋白3.3和組蛋白4表達(dá)上調(diào)。
使用高通量定量蛋白質(zhì)組方法,評估在脂多糖(LPS)與缺氧/缺血(H/I)聯(lián)合誘導(dǎo)的CP大鼠模型中海馬和運動皮層的蛋白組學(xué)變化。在每個大腦區(qū)域都發(fā)現(xiàn)了2000多種蛋白質(zhì)。定量分析顯示,LPS和H/I誘導(dǎo)之后除了運動系統(tǒng)的破壞外,海馬和運動皮層蛋白質(zhì)組的也發(fā)生了嚴(yán)重的紊亂。
相比之下,白脈軟膏的局部應(yīng)用不僅緩解了CP大鼠模型的運動缺陷,而且恢復(fù)了大腦皮層的蛋白質(zhì)組。此外,在白脈處理的CP大鼠大腦中,海馬中的星形膠質(zhì)細(xì)胞被強(qiáng)烈激活,這與神經(jīng)營養(yǎng)因子的增加有關(guān)。
蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明,CP模型可誘導(dǎo)大腦神經(jīng)炎癥反應(yīng),而局部應(yīng)用白脈軟膏的則逆轉(zhuǎn)了這一反應(yīng)。本研究突出了海馬和運動皮層神經(jīng)元在CP進(jìn)展和治療中的意外作用,從而為CP提供了潛在的新治療靶點。